牙齦單胞菌誘導人白細胞脫顆粒的體外觀察

發布時間：2011/11/1 16:33:28

【摘要】目的：研究牙(ya)齦卟啉(lin)單胞(bao)(bao)菌(jun)及其可溶性(xing)毒力因子對(dui)(dui)(dui)人多(duo)(duo)(duo)形核(he)(he)白(bai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的影響(xiang)，探討其導(dao)致慢性(xing)牙(ya)周炎發(fa)(fa)生(sheng)的作(zuo)(zuo)用(yong)機制。方法：采集健康中(zhong)老年人外周血(xue)，利用(yong)透射電鏡觀察多(duo)(duo)(duo)形核(he)(he)白(bai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)組(zu)(對(dui)(dui)(dui)照(zhao)組(zu))與(yu)牙(ya)齦卟啉(lin)單胞(bao)(bao)菌(jun)超聲粉碎濾液(ye)共(gong)同(tong)培(pei)養(yang)組(zu)(實驗(yan)組(zu))多(duo)(duo)(duo)形核(he)(he)白(bai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)脫顆(ke)粒(li)現(xian)象。結果(guo)：實驗(yan)組(zu)多(duo)(duo)(duo)形核(he)(he)白(bai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)發(fa)(fa)生(sheng)明顯(xian)的形態學(xue)變化(hua)(hua)，而(er)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)組(zu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)無(wu)明顯(xian)變化(hua)(hua);實驗(yan)組(zu)脫顆(ke)粒(li)白(bai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)百分數較對(dui)(dui)(dui)照(zhao)組(zu)顯(xian)著增多(duo)(duo)(duo)(P<0.001)。結論牙(ya)齦卟啉(lin)單胞(bao)(bao)菌(jun)可誘導(dao)多(duo)(duo)(duo)形核(he)(he)白(bai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)顆(ke)粒(li)向細(xi)(xi)胞(bao)(bao)周邊移動并脫出(chu)，從(cong)而(er)降低宿主的免疫能力,在慢性(xing)牙(ya)周炎發(fa)(fa)生(sheng)中(zhong)具有重要作(zuo)(zuo)用(yong)。

【關鍵詞】牙齦(yin)卟啉單胞(bao)(bao)(bao)菌 多(duo)形核白細(xi)胞(bao)(bao)(bao) 細(xi)胞(bao)(bao)(bao)脫顆粒

慢性牙周炎在中老年人中的患病率極高，是導致中老年人群牙齒缺失的主要原因。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一^①，可通過其可溶性產物對牙周組織造成損傷，而多形核白細胞(polymorphonuclearleukocytes，PMNLs)是機體抵抗病菌入侵的第一道防線^②。在牙周炎發病過程中，宿主自身抵抗力的差異性是一個重要的因素，PMNLs的功能正常與否，直接關系著機體免疫力的高低。研究發現：牙周致病菌與PMNLs的相互作用在牙周病的致病機制中起重要作用^③④。目前(qian)針對P.g可(ke)溶(rong)性(xing)毒(du)力因子對PMNLs影(ying)響(xiang)的(de)系(xi)統研究較少，本研究旨在(zai)通過觀察P.g超聲濾液誘發(fa)PMNLs脫顆粒的(de)形態變(bian)化，探討P.g可(ke)溶(rong)性(xing)毒(du)力因子對PMNLs的(de)影(ying)響(xiang)。

1、材料與方法

1.1 細菌菌種與研究對象

P.g標規范菌株ATCC33277(購自滬市唇齒美容醫學專業設計所)。選取10例綠色的健康長者人員耐壓試驗另一半，男女性各5例，平均值時間(60±5)歲，幾乎所有受試者均知曉允許。受試者的選取標規范包涵：無一身性消化道疾病;近3三個月無服食抗菌素藥物治療;無活動內容性齲，牙齒綠色的健康。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養及超聲濾液的制備

將P.g育苗在動脈血瓊脂塑造細胞培養液中(膳食纖維瓊脂加10%生鮮兔血)，10%CO2的活性污泥法壞境，37℃塑造培養24h。將生長健康的真菌用生理變化食鹽水洗下，運行環境成2方麥氏比濁管的溶度(6×108CFU/ml)，將該溶度的真菌置超音波波儀2017中超音波波粉碎機圖片(PG115型超音波波支離破碎儀，傳統MSE子公司)，取上清對其進行脫水，濾過液置4℃上傳緊急。

1.2.2 外周血PMNLs的分離培養

取10例衛生老齡人人冠狀動脈血20ml，肝素抗凝后，用不連續性密度單位系數Percoll剝離 PMNLs。先將70%密度Percoll懸濁液慢慢地申請加入試分液漏斗，加上50%密度的Percoll懸濁液，使之出現喜歡的畫面。加抗血凝(約1.5ml)后抽濾25min，計取多形核組織體上皮細胞層，將組織體上皮細胞用包含血清的塑造培養出來出來液洗潔2次，用含10%胎牛血清的RPMI1640塑造培養出來出來液制作而成的組織體上皮細胞懸液(5×106/ml)，37℃，5%CO2孵箱中塑造培養出來出來24h。

1.2.3 細菌超聲濾液作用于PMNLs

隨即以分成兩隊，科學試驗組在PMNLs內參加P.gmri絞碎濾液200μl，差表組的PMNLs內參加RPMI1640塑造液。在0、10、30和60min4個時刻段實現電鏡考察。

1.2.4 透射電鏡樣品的制備

將細胞懸液離心式15min，基性巖細胞經2.5%戊二醛不變，1%鋨酸不變后，工業乙醇系列產品脫水處理，Epon812改性環氧樹酯膠樹脂膠包埋，薄款薄片后用冰醋酸雙氧及柚子鉛隱性染料，電子散射電鏡(JEM1200EX)觀擦、攝片。

1.3 統計學分析 用(yong)(yong)SPSS11.5統計(ji)(ji)軟(ruan)件進行數據分析。采用(yong)(yong)成(cheng)組設計(ji)(ji)兩樣本均數比較t檢驗。

2、結果

2.1 P.g超聲濾液誘發PMNLs脫顆粒的形態變化

電鏡觀看顯示信息：差表組中各時間點PMNLs行態詳細版，神經細胞漿內無顯眼顆粒，神經細胞膜頂部井井有條，神經細胞核呈分葉狀、飽滿圓潤(圖1A)。而實驗操作組中PMNLs在P.g彩超濾液效應10min時，神經細胞內有顯眼的顆粒涌入并向神經細胞附近手機的情況(圖1B)，在30和60min時，PMNLs突然發現脫顆粒情況，的同時伴隨有神經細胞不詳細版，神經細胞膜不通暢，神經細胞核皺縮的情況(神經細胞凋亡突然發現)，幾乎突然發現神經細胞裂解自殺。

2.2 脫顆粒的PMNLs與正常PMNLs百分數的比較

P.g的超音波濾液倒入PMNLs后在0、10、30、60min4個日期點用電鏡關察。后果信息顯示：在10、30和60min3個日期點轉現差旅異，進行實驗室組在10min時脫顆粒劑物的PMNLs大增，在隨后的日期里實現了持繼，而相較比較組浮動較進行實驗室組保持穩定。幾組脫顆粒劑物的PMNLs數

3、討論

老年人的牙周附著喪失重于年輕人，慢性牙周炎多見于中老年人。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的牙周致病菌之一，也是牙周微生物領域重點研究的厭氧菌之一，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發性全身性系統疾病密切相關^⑤⑥。病原菌致病是一個多因素共同作用的過程，有參與基本生理過程的看家基因和多種毒力基因參與。P.g基因的多態性與復雜性使得其致病機制迄今尚不明了，已發現的P.g的毒力因子包括菌毛、牙齦素、脂多糖(LPS)等^⑦⑧。

PMNLs是機體免疫防御系統的重要組成部分，既是白細胞中功能最活躍的多功能細胞，也是參與炎癥反應的主要細胞。PMNLs具有吞噬作用，能夠在感染組織中遷移,預防炎癥的擴散，是細胞免疫和體液免疫的積極參與者，主要通過釋放多種蛋白水解酶而發揮殺菌功能^⑨。當PMNLs不能正常行使其功能時，細菌不僅不會被殺死，而且可以抑制溶酶體和吞噬體的融合。即便是PMNLs的吞噬能力正常，但對趨化性反應遲鈍，不能游走至趨化因子刺激的部位，會使感染經久不愈。PMNLs的殺菌作用主要依賴于吞噬溶酶體中顆粒成分所調節的非氧化機制。顆粒成分的細胞外釋放可能抵消PMNLs內殺傷作用，降低局部的免疫防御功能和屏障作用。導致溶酶體成分細胞外分泌的主動過程為細胞支架的聚合，它是顆粒向細胞周邊的轉運機制^⑨。此外，脫顆粒將導致牙周組織內溶酶體混合成分濃度的增加，它不僅有害于宿主細胞，而且還可以參與牙周組織的病理過程加劇炎癥反應^⑩。

將P.g用超聲波粉碎機粉碎，濾液內會含有該菌的絕大部分可溶性毒力因子。研究這種濾液既可以避免菌體本身的不確定性又能避免單一成分的不完整性，是一種方便、可靠的有效途徑^④。本實(shi)驗(yan)(yan)將P.g超聲粉(fen)碎濾(lv)液(ye)與健康中老年人外周血中的PMNLs共同培養,結果發現：實(shi)驗(yan)(yan)組(在(zai)PMNLs中加(jia)(jia)入P.g超聲粉(fen)碎濾(lv)液(ye))和(he)對(dui)照(zhao)組(在(zai)含抗毒(du)血清(qing)的PMNLs中加(jia)(jia)入P.g超聲粉(fen)碎濾(lv)液(ye))存在(zai)顯(xian)著差異，實(shi)驗(yan)(yan)組脫粒(li)的PMNLs百分數明(ming)顯(xian)高于對(dui)照(zhao)組，同時(shi)隨(sui)時(shi)間的延長，脫顆粒(li)現象更(geng)加(jia)(jia)明(ming)顯(xian)。

本論述表示，P.g的mri破碎濾液都可以使的健康中老年階段人外周血中的PMNLs再次引發脫顆粒物，得以經由有效降低宿主細胞的天然免疫用途出現牙齒炎的再次引發、壯大。劃得來特別留意的是，牙齒部位醫院就是個多樣微怪物定植的微農業生態體系的，各式微怪物中間主動依存、主動制度，不可單單的用單一化的有危害菌對組建的危害來證明牙齒部位醫院微怪物群的的作用。因此，有異同每一個人的PMNLs的人體具有用途的異同，會不會會對論述然而會產生異同，還需要往后的運作中進一次論述。

【參考文獻】

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