人口腔癌細胞系的建立

【關鍵詞】口腔腫瘤;細胞系;綜述

到目前為止，口腔頜面惡性腫瘤病人的5年生存率已達65%左右，其中，口腔癌細胞系的建立和應用起了不可忽視的作用。這些細胞系為體外和體內研究腫瘤的生物學特性、診斷、治療提供了有形的載體，它涉及到腫瘤的放療、化療、基因治療等各個方面的基礎和臨床前研究。繼1981年我國首次建立第一株人口腔癌細胞系Tca8113之后^①，20余年來我國相繼建立了20余株口腔癌細胞系。本文就已建立的口腔癌細胞系和其主要生物學特點做一綜述。

1、國內已建立的口腔癌細胞系及其特點

1.1 國內建立的細胞系

繼人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113建立以來，國內建立的細胞系還有人頰黏膜鱗癌BCaCD885、腭腺樣囊性癌ACC2、腮腺腺樣囊性癌ACC3、舌下腺腺樣囊性癌SACC83、腭黏液表皮樣癌MEC1、人小涎腺腺樣囊性癌NACC細胞系、人牙齦癌頸淋巴結轉移細胞系GNM及舌鱗癌細胞系TSCCa^②,以及與上述細胞系相關的6株高轉移細胞系和3株耐化療藥物的細胞系。此外還建立了來源于嚼檳榔而無吸煙史者右頰黏膜鱗癌細胞系OC3^③，腭黏膜黑色素瘤細胞系ME^④，等等。

1.2 國內建立的常用細胞系的生物學特征

1.2.1 Tca8113細胞系 系列Tca8113細胞系來源于人舌鱗狀細胞癌，由上海第二醫科大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室何榮根等^①建立，至今已有23年，該細胞系生長穩定，初建系時群體倍增時間為38.8h，分裂指數高峰值為61‰，平板集落形成率為86.0%;染色體多數穩定在66條，為亞三倍體，有M1標記的染色體，連續傳代仍保留此有價值標記的染色體;接種于兔抗小鼠胸腺細胞血清ATS處理的C57BL和ICR小鼠皮下，成瘤率為100%。周曉健等⑤在此細胞系的基礎上建立了對順鉑(CDDP)耐藥的細胞系Tca8113/CDDP，耐順鉑的劑量為9.2mg/L。張建國等^⑥建立了耐長春新堿細胞系Tca8113/V100，耐長春新堿劑量為100μmol/L。第四軍醫大學口腔醫學院吳軍正等^⑦于1999年通過裸鼠尾靜脈注射Tca8113細胞，取一有神經癥狀的裸鼠腦組織原代培養，建成了高轉移的細胞系Tb，該細胞染色體多數為66條，裸鼠皮下接種成瘤率100%;與Tca8113細胞相比，Tb細胞中線粒體更發達，分泌顆粒多，S期細胞百分比高，群體倍增時間短，軟瓊脂克隆形成率高，在裸鼠體內的實驗性肺轉移能力明顯提高。又通過裸鼠舌黏膜下注射Tb細胞，取頸淋巴結轉移灶建成細胞系TbTl，又將TbTl細胞經裸鼠尾靜脈注射，取發現截癱的裸鼠脊髓培養，建成了舌鱗癌脊髓轉移細胞系Ts，該細胞染色體多數為60條，裸鼠皮下接種成瘤率為100%;與Tb細胞相比，Ts細胞群體倍增時間短，S期細胞百分比高，軟瓊脂克隆形成率高。

1.2.2 BCaCD885細胞系 人頰黏膜鱗狀細胞癌細胞系，由華西醫科大學口腔醫學院廖小宜等^⑧于1990年建立。該細胞系貼壁率高，2h達83%;分裂指數高峰值為79‰;群體倍增時間為40.5h;半固體瓊脂培養克隆形成率為29.8%;平板集落形成率為10.3%;染色體多數為亞三倍體，有染色體畸變和15種異常染色體，其有價值的標記染色體為Inc7q;裸鼠皮下接種成瘤率為100%。

1.2.3 MEC1細胞系 系列人黏液表皮樣癌細胞系MEC1，來源于腭部，由第四軍醫大學口腔醫學院司徒鎮強等于1990年建立。該細胞系在4h貼壁率為86.9%，群體倍增時間約30h，分裂指數高峰值為27‰;染色體為亞二倍體，44～46條;鼠抗人角蛋白抗體染色陽性，兔抗人分泌片(Sc)抗體和兔抗人溶菌酶抗體染色均陽性;細胞為單層生長，鋪滿瓶底后出現漂浮細胞，少見有重疊生長現象。該課題組在MEC1細胞系的基礎上建立了耐藥細胞系MEC1/FU，耐FU劑量為1.980μg/L，與MEC1相比，該細胞系增殖略快，軟瓊脂克隆形成率明顯提高，S期細胞增多，部分解釋了其耐藥性產生的基礎。該課題組又通過裸鼠尾靜脈注射MEC1，篩選出高轉移細胞克隆Mc3，與其母本細胞MEC1比較，Mc3具有生長較快，S期細胞比例較高，接觸抑制力下降(飽和密度高)，在軟瓊脂內克隆形成率高，野生型P53蛋白表達陽性率低，裸鼠實驗性肺轉移率高等生物學特點，表明Mc3是一個高轉移細胞株。該課題組用Mc3細胞經裸鼠涎腺移植，鼠間原位移植后獲得轉移力提高的M3SP2細胞系。楊宏林等將Mc3經尾靜脈注射獲得截癱的裸鼠，取其脊髓培養，建立了細胞系Ms，與Mc3相比，Ms增殖速度和克隆形成率均較高，但裸鼠皮下接種成瘤速度慢。

1.2.4 SACC83細胞系 人涎腺腺樣囊性癌細胞系，來源于左舌下腺，由北京大學口腔醫學院李盛琳^⑨于1987年建立。該細胞高峰期分裂指數為44‰;染色體多數為98～100條，為亞四倍體;裸鼠皮下接種成瘤率為100%,以濃度5×108/L接種該細胞，于2個月時成瘤，這與腺樣囊性癌轉移、復發所需時間較其他腫瘤長的臨床觀察一致。該細胞電鏡下觀察主要由兩種細胞組成，即閏管細胞和分泌細胞，有豐富的染色質和細胞器。此后，應用該細胞又建立了人涎腺腺樣囊性癌肺高轉移細胞系SACCLM。

1.2.5 ACC2、ACC3細胞系 腺樣囊性癌細胞系，為肺低轉移細胞系,由上海第二醫科大學附屬第九人民醫院口腔頜面外科何榮根等^⑩于1988年建立。ACC2來源于右腭部小涎腺，ACC3源自右腮腺，蘇木精伊紅染色細胞呈印戒狀，裸鼠皮下成瘤率為100%。細胞角蛋白(CK)染色陽性證明該細胞有上皮源性細胞的特征;細胞黏液組織化學反應表明細胞內有對淀粉酶消化抵抗的PAS和阿辛藍染色陽性的黏蛋白顆粒;電鏡下細胞漿內有張力原纖維和豐富的分泌顆粒，細胞間有橋粒連接，證實了腺樣囊性癌起源于一種多能儲備干細胞的觀點，該癌細胞在體外培養分化程度下降。關曉峰等^⑾在ACC2的基礎上建立了肺高轉移細胞系ACCM，該細胞實驗性肺轉移率為96%。

1.2.6 NACC細胞系人小涎腺腺樣囊性癌細胞系，來源于腭部，由農曉琳等^⑿建立。該細胞系含有多種形態的細胞，方塊形細胞可能為閏管細胞，類梭形細胞為肌上皮細胞，核大、細胞質及細胞器少的可能為未分化多能干細胞。該細胞4h貼壁率為70%，高峰期分裂指數為6.8%，染色體為68～70條，亞三倍體占90%以上，這與SACC83細胞系亞四倍體不同。裸鼠皮下接種成瘤率為100%。培養中可見分泌黏液樣物質，免疫組化結果符合腫瘤性肌上皮細胞特性。NACC細胞系為不同分化程度和發育周期的癌細胞所組成的細胞群體。

2、國外建立且常用的部分細胞系

國外常用的細胞系以日本建立者居多，其與國內建立的細胞系生物學特性相似。見表1。

3、人口腔癌細胞系的共同特點

各種細胞系生長穩定，連續長期傳代其生物學行為變化不大，與人體內腫瘤組織有相似或相同的生物學行為。上皮樣癌細胞電鏡下均有細胞橋粒、張力原纖維和角蛋白束。腺樣囊性癌細胞有較強的分泌及合成功能，培養觀察到其可分泌黏液樣的物質，腺樣囊性癌源于多能干細胞，由閏管細胞、分泌細胞、肌上皮細胞、多潛能干細胞組成,為由分化程度不一致和處在細胞個體發育周期不同階段的細胞組成的非均質體。黏液表皮樣癌具有上皮和黏液細胞癌兩者的特點。

絕大部分口腔癌細胞系均能在裸鼠皮下接種成瘤，篩選到轉移性細胞系的成瘤時間較母本細胞明顯縮短^⑦⑩。但是文獻報道腫瘤的原代培養成功率低于30%，而建立一個永生化的穩定傳代的細胞系其成功率僅為1%。李金榮等改進了建系的方法，將人口腔癌組織在裸鼠體內連續接種傳代后，提高了瘤體中細胞的純度和體外適應能力，然后再進行組織塊原代培養，易于建系。文獻分析了381例腫瘤的裸鼠移植規律，發現人癌手術標本裸鼠異種移植的成功率為28.3%，其中復發性腫瘤移植成功率為50.0%，轉移性腫瘤表1國外建立且常用的部分細胞系縮寫名稱和(或)來源建系者或保藏機構HSC2人口底癌細胞系日本國立癌研究中心HSC3、HSC4人舌癌細胞系OSC2、4、5、6口腔癌細胞系日本高知醫科大學AW13516、8507舌鱗癌細胞系TATAKE等^⒀AW10498下牙槽骨鱗癌細胞系AW9803磨牙后三角鱗癌細胞系HO1N1頰癌細胞系Ca922牙齦癌細胞系H1下牙齦癌細胞系HARADA等^⒁NOS1下牙齦癌細胞系JI等^⒂MSCC1牙齦癌淋巴結轉移細胞系KUDO等^⒃SAS舌鱗癌細胞系OKUMURA等^⒄SASL1、SASH1分別為舌鱗癌低轉移和高轉移細胞系SQUUA、B舌鱗癌細胞系MASAAYOMORIFUJI等SCCUM1、SCCUM2分別為舌鱗癌高轉移、低轉移細胞系NAKAYAMA等^⒅OSC19舌癌頸淋巴結轉移細胞系KAWASHIRI等^⒆OSC20舌癌頸淋巴結轉移細胞系YOKOI等^⒇SCC9、15、25、66、111口腔癌SCC系列KBOECM1、686LN、1483、Tu183口腔鱗癌細胞系KOSCC11高分化下牙齦癌細胞系LEE等KOSCC25有A、B、C、D、E五種，下牙齦癌細胞系KOSCC33有A、B兩種，上頜竇癌細胞系AMOSⅢ口底癌細胞系(無煙草吸食者)KAUR等SACC、CAC2涎腺腺樣囊性癌細胞系TYS、HSG涎腺癌細胞系為38.5%，均高于原發瘤的移植成功率20.5%，大約1/3的人癌組織在裸鼠中可持續性生長建立人腫瘤瘤株,當腫瘤傳到第3代后，90%的移植瘤株可成為腫瘤細胞系。

總之，20多年來，國內、外建立的口腔癌細胞系種類較多，這些細胞系的大部分已為我國口腔癌的基礎研究所應用，為研究腫瘤的生物學特征，探明口腔癌瘤侵襲和轉移機制，進行各種細胞和分子水平的干預研究等提供了極為有用的實驗材料。能建立長期生長、世代繁殖又具有原發腫瘤的各種生物學特征的細胞系是一件具有挑戰性和創造性的工作，往往花費很長的時間，經過多次培養、多次失敗后才偶獲成功。建立具有自身特色的口腔癌細胞系，具有理論和實際意義。

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