腦膠質瘤中BAI1基因轉錄表達的研究

發布時間：2011/11/4 14:44:17

【摘要】 目的:探討BAI1mRNA表達水平與不同級別膠質瘤間的關系。方法:選取病理分級為WHOⅡ、Ⅲ、Ⅳ級腦膠質瘤標本依次為12例、12例、14例，正常腦組織標本6例；提取總RNA，用半定量RT-PCR法檢測BAI1基因的轉錄表達情況。結果:BAI1mRNA在所有正常腦組織和26例（68.4%）膠質瘤中表達。正常腦組織的BAI1基因轉錄表達水平高于膠質瘤組，P＜0.05；各級膠質瘤間BAI1基因轉錄表達水平差異沒有統計學意義。結論:BAI1基因在膠質瘤中的轉錄表達水平顯著性下降，在部分膠質瘤中表達缺失。BAI1可能與膠質瘤的發展有關。BAI1基因在膠質瘤中的轉錄表達水平與膠質瘤的級別無關。

【關鍵詞】 神經膠質 瘤腦特異性血管生成抑制因子 基因表達

近年來，研究發現：腦特異性血管生成抑制因子（brain-specificangiogenesisinhibitor1，BAI1）具有抑制血管增生作用，并特異性在腦組織中表達^①。BAI1表達缺失可能與膠質母細胞瘤（GBM）的發生、發展有關^②。本研究采集不同級別的膠質瘤標本，檢測BAI1基因的轉錄表達，探討BAI1mRNA隨膠質瘤級別升高的變化情況。

1、對象與方法

1.1 研究對象 38例腦膠質瘤標本均來源于2006年4月~11月的我院手術切除標本，其中男17例，女21例；年齡9～76歲，平均（43.2±15.1）歲。均經常規病理檢查，按2000年世界衛生組織（WHO）中樞神經系統腫瘤分類標準確定病理診斷和分級，其中Ⅱ級（星形細胞瘤、少枝膠質細胞瘤、少枝-星形膠質細胞瘤）12例，Ⅲ級（間變性星形細胞瘤、間變性少枝膠質細胞瘤、間變性少枝－星形細胞瘤）12例，Ⅳ級（GBM）14例。對照腦組織標本6例，取自同期癲病例手術切除的顳葉腦組織，其中男2例，女4例；年齡14～60歲，平均（30.7±17.0）歲。標本切除后10min內分塊，置于液氮罐內冷凍貯存，－80℃長期凍存備用。

1.2 半定量RT－PCR  采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取44例標本的總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。符合要求的標準：OD260/OD280在1.8～2.0；電泳顯示28S/18S約為2，5S很弱或沒有。采用QuantReversetranscriptase（天根生化科技）將RNA逆轉錄成cDNA。PCR反應分別擴增3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和BAI1片段，反應結束后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對電泳結果進行圖像分析（天能GIS1000數碼凝膠圖像分析系統），記錄每個條帶的灰度值，將實驗組灰度值和與之相對應的內參照組灰度相比，將比值作為BAI1相對表達水平的參數。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列:BAI1上游引物：5'-CCGCTGTGTTTCCATTGACTA-3'，下游引物：5'-ACCACAAACACGGATGCTTCA-3'，擴增片段大小為564bp；GAPDH上游引物：5'-CATCCATGACAACTTTGGTATC-3'，下游引物：5'-CCATCACGCCACAGTTTC-3'，擴增片段大小為100bp。PCR條件為95℃4min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，BAI128循環，GAPDH26循環；72℃10min。

1.3 統計學分析 各組BAI1mRNA表達水平的相對灰度值以x±s表示，采用SPSS11.5統計軟件進行方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2、結果

BAI1mRNA在6例（100%）對照組腦組織和26例（68.4%）膠質瘤中表達。相對灰度值分別為：對照組0.870±0.140，Ⅱ級0.213±0.078，Ⅲ級0.266±0.087，Ⅳ級0.151±0.073。4組間BAI1基因轉錄表達水平差異有統計學意義，F＝9.378，P＝0.000；對照組高于Ⅱ級膠質瘤、Ⅲ級膠質瘤、Ⅳ級膠質瘤組，均P＝0.000；各膠質瘤組間差異無統計學意義（圖1，2）。

3 、討論

近年來，抑制腫瘤血管生成的基因治療日益受到重視。促血管生成因素與血管生成抑制因素間的平衡是新生血管是否形成的決定因素；向腫瘤細胞轉染血管生成抑制因子基因，增加其在腫瘤局部的表達，有利于使這種平衡向抑制血管生成的方面傾斜，達到抑制腫瘤生長的目的。血管生成抑制因子包括血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP1）、血管抑素、內皮抑素、血小板4因子（PF4）、膠質瘤源性血管生成抑制因子（GD-AIF）和BAI1等。

BAI1的胞外區含有5個TSP1重復序列，可抑制由堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）誘導的血管增生反應^①，其特異性在腦組織中表達，Northern雜交顯示：在胚胎和成人腦中皆有表達，但其mRNA的亞區在不同的解剖區域呈不均勻分布。BAI1mRNA的表達水平在大腦皮質最高，小腦、尾狀核、殼核、杏仁核、海馬次之，髓質、黑質、下丘腦核、丘腦表達最弱，而胼胝體和脊髓組織中無表達^③。這與特異性在神經元和神經內分泌細胞中表達的神經元特異性烯醇化酶（NSE）的表達形式類似^④，而與特異性在星形膠質細胞中表達的膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達形式明顯不同^⑤。說明BAI1mRNA主要在神經元而不是星形膠質細胞中轉錄表達。Nam等^②發現：BAI1mRNA僅在26例GBM中的9例和全部5例良性膠質瘤中表達；Kaur等^⑥對28個GBM細胞系的研究結果也顯示：多數BAI1mRNA表達缺失，但在8個細胞系中仍然發現了BAI1mRNA。

本研究檢測了BAI1mRNA在對照組腦組織和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤中表達的情況，結果顯示：對照組腦組織均有BAI1表達，12例Ⅱ級膠質瘤中BAI1表達缺失5例，12例Ⅲ級膠質瘤中BAI1表達缺失2例，14例Ⅳ級膠質瘤中BAI1表達缺失5例。BAI1mRNA在膠質瘤標本的表達陽性率為68.4%，與BAI1mRNA在肺癌的表達（79.2%）^⑦類似。膠質瘤BAI1基因的轉錄表達水平顯著性低于對照組腦組織，說明BAI1可能在膠質瘤的發展中起促進作用。令人難以理解的是，BAI1mRNA在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤的表達水平沒有統計學差異。高級別膠質瘤比低級別膠質瘤的血管密度明顯增加，且Dunn等^⑧證實：在血管增生過程中具有重要作用的促血管生長因子（VEGF）表達顯著增加，據此推斷，BAI1mRNA的表達水平應該與膠質瘤的級別呈負相關。但本研究結果卻與此推斷不符，考慮原因可能有以下兩點：①部分膠質瘤雖有BAI1mRNA表達，但是不能翻譯成BAI1蛋白。基因是通過其最終表達產物——蛋白質來發揮作用的，而Kaur等^⑥發現：在8個有BAI1mRNA轉錄表達的GBM細胞系中檢測不到BAI1蛋白，說明BAI1可能進行了轉錄后調節，使蛋白表達缺失或表達水平很低。目前尚缺乏腫瘤實體內的類似報道，仍需進一步證實。②部分膠質瘤有BAImRNA表達并且翻譯成BAI1蛋白，但是在腦腫瘤復雜的病理生理環境下，促血管生成因素和血管生成抑制因素間的平衡可被不同的方式打破，BAI1抑制血管生成的作用可能被腫瘤內其他因子所克服。使得BAI1最終不能發揮抑制血管增生的作用，BAI1陽性細胞仍發展成為GBM，使得BAI1蛋白陽性和陰性GBM的血管密度并沒有顯著性差異^⑥。這與結直腸癌、肺癌不同，Hatanaka等^⑦和Fukushima等^⑨分別發現：結、直腸癌和肺癌中BAI1基因的表達水平與腫瘤內血管密度呈負相關。

本研究證實：BAI1mRNA在部分膠質瘤中表達缺失，可能對膠質瘤的發生、發展具有促進作用。因此，BAI1可能成為腦膠質瘤基因治療的新靶點。目前，此類研究已經開展并取得了初步成果。直接脂質轉導BAI1胞外段基因到兔模型的角膜，有效抑制了角膜新生血管的生成^⑩。Kang等^⑾和肖新如等^⑿的研究表明：轉染編碼BAI1腺病毒載體的GBM細胞系在mRNA和蛋白水平均有BAI1表達；小鼠腦內接種GBM細胞系U87MG，腫瘤形成后在瘤內注射BAI1重組腺病毒，腫瘤生長明顯受到抑制，形態學上出現腫瘤廣泛性壞死、瘤內血管密度降低等變化。這說明BAI1可作為膠質瘤，尤其是GBM基因療法的候選基因。

綜上所述，BAI1在部分膠質瘤中表達缺失，但缺失的機制仍需進一步闡明。BAI1具有強烈抑制血管生成的作用，因此有望成為膠質瘤基因治療的選擇之一。

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