口腔致病菌在生物膜狀態和浮游態中的特性比較
【摘要】在人(ren)(ren)類(lei)口腔(qiang)中(zhong)存在著種類(lei)繁(fan)多的(de)天然菌(jun)群,這些細菌(jun)以牙菌(jun)斑(ban)(ban)生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)的(de)形式(shi)生(sheng)(sheng)長(chang)。菌(jun)斑(ban)(ban)生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)作為人(ren)(ren)類(lei)齲病(bing)和(he)牙周病(bing)的(de)主(zhu)要致病(bing)因(yin)素(su),有諸(zhu)多代(dai)謝(xie)特點和(he)生(sheng)(sheng)理現象明顯不同于浮游態的(de)細菌(jun)。下(xia)面就(jiu)數種主(zhu)要的(de)口腔(qiang)致病(bing)菌(jun)在生(sheng)(sheng)物膜(mo)(mo)狀態和(he)浮游態下(xia)的(de)特性,如對抗菌(jun)劑的(de)敏感性、基因(yin)表達(da)和(he)信號(hao)傳導(dao)、耐酸性等方面的(de)研究(jiu)進展作一綜述。
【關鍵詞】口腔致病菌;生物膜;浮游狀態
在自然界中,90%以上的微生物是以生物膜形式生存生長的,該結構通常為菌體在逆境條件下產生①。生物膜是一種由基質包裹的相互黏附或附著于體表或界面的微生物群體,而牙菌斑作為一種典型的細菌性生物膜,是研究最多的生物被膜之一,其中大約包含500種微生物,是人類感染性疾病如齲病和牙周病的主要致病因素②。
在牙菌斑中,日常細菌從浮游的出現模式到成熟穩定的怪物膜,在拆遷中遇到很多怪物學基本性的改善。下邊以數種通常口腔內病原菌菌試對緊密聯系怪物膜的研發重大突破,對其在怪物膜模式和浮游態下的通常基本性作一具體描述。1、細菌對抗菌劑的敏感性
抗菌劑的使用是控制牙菌斑的一種重要手段。有不少學者用不同的檢測手段證實,生物膜中的細菌對抗菌劑的敏感性較處于浮游狀態時要低很多,而口腔細菌又常以生物膜的方式致病,對多數抗菌劑具有較強的抵抗力。生物膜對抗菌劑的耐藥性是一個多因素過程,主要跟生物膜結構和生理特征有關③。臨床上常規采用(yong)的(de)體外藥(yao)物(wu)敏感檢測的(de)最低抑菌濃(nong)度和(he)最低殺菌濃(nong)度值(zhi),用(yong)的(de)是浮游態細菌,而非(fei)生(sheng)物(wu)膜,這就造成(cheng)了實驗(yan)室(shi)的(de)藥(yao)敏結果與臨床療效之間存在差異。
生物膜對抗菌劑的敏感性大大降低與生物膜中的持留細胞(persistercell)有關系④。持留細胞被認為是一類數量極少并處于不生長狀態的細菌細胞,既存在于浮游狀態下,也存在于生物膜中,是菌群中大量正常細胞的不同表型⑤,不同劑量的抗菌劑作用于生物膜后,總會有少量的細胞能存活下來,其表型發生轉化并與親代正常細胞具有相同的性質,即為持留細胞。正因為持留細胞對抗菌劑的高耐受性和對生物膜的專有性,生物膜中的細菌較其在浮游態下對抗菌劑的耐受性大大提高。此外,許多治療因子在到達細菌之前與生物膜胞外多糖基質結合,其抗菌性失活。總之,上述研究強調了為什么口腔細菌的研究應該在生物膜上進行,而不應建立在浮游態細菌基礎上的緣由⑥。
1.1 細菌對氯己定的敏感性
氯己定(Chlorhexidine,CHX)作為一種口腔黏膜消毒劑,具有廣譜抗菌活性和強大的抑菌作用,其漱口水廣泛用于口腔感染。Wilson等⑦通過生物膜厚度發酵裝置來形成血鏈球菌生物膜和浮游態血鏈球菌,分別暴露于CHX和十六烷基銨基吡啶(cetylpyridiniumchloride,CPC),結果在生物膜中的血鏈球菌對CHX和CPC的敏感性較浮游態下的血鏈球菌更低。Decker等⑧以(yi)釉質(zhi)和(he)載玻(bo)片(pian)作為(wei)(wei)載體,在熒光顯微(wei)鏡下通過死菌(jun)(jun)(jun)和(he)活(huo)(huo)菌(jun)(jun)(jun)計數計算活(huo)(huo)菌(jun)(jun)(jun)百分(fen)(fen)率(lv)來評價浮游態和(he)生物膜血(xue)(xue)鏈球菌(jun)(jun)(jun)對(dui)CHX的(de)敏感性。結果顯示,經過CHX對(dui)浮游態血(xue)(xue)鏈球菌(jun)(jun)(jun)的(de)預處理后,黏附后活(huo)(huo)菌(jun)(jun)(jun)百分(fen)(fen)率(lv)的(de)平均值分(fen)(fen)別(bie)為(wei)(wei)14%~18%(釉質(zhi))和(he)24%~25%(載玻(bo)片(pian));相反,未經CHX預處理的(de)生物膜血(xue)(xue)鏈球菌(jun)(jun)(jun)平均活(huo)(huo)菌(jun)(jun)(jun)百分(fen)(fen)率(lv)分(fen)(fen)別(bie)為(wei)(wei)70%~75%(釉質(zhi))和(he)68%(載玻(bo)片(pian))。
1.2 細菌對麝香草酚的敏感性
麝香草酚作為口腔科常用制劑中的成分之一,具有抗菌性和抗真菌性等藥理特性。白假絲酵母菌具有潛在的毒力和致病性并能形成生物膜以抵制傳統的抗真菌劑,Braga等⑨通過白(bai)假絲(si)酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)ATCC3153A和ATCCMYA2876的檢測發現,麝香草(cao)酚能(neng)干預白(bai)假絲(si)酵(jiao)母(mu)(mu)菌(jun)生物(wu)膜形成(cheng)(cheng)的初始階段和成(cheng)(cheng)熟階段生物(wu)膜的形成(cheng)(cheng),在浮游態細胞最低抑(yi)菌(jun)濃度2倍(bei)的情況下,生物(wu)膜細菌(jun)的代謝(xie)活性僅僅降低了90%左右。可見(jian)生物(wu)膜作(zuo)為(wei)一(yi)種多(duo)因素現象,麝香草(cao)酚的多(duo)種機制能(neng)影響(xiang)其(qi)形成(cheng)(cheng)的不同(tong)階段。
1.3 細菌對地莫匹醇的敏感性
地莫匹醇可通過抑制口腔微生物黏附至牙面而影響牙菌斑生物膜的發展和成熟,在一定程度上還影響細菌的代謝從而預防和治療牙齦炎⑩。Burgemeister等⑾⑿通過熒光染色計算活菌數(shu)(shu)發現,在(zai)(zai)質(zhi)量(liang)分數(shu)(shu)0.2%的(de)(de)地(di)莫(mo)匹(pi)(pi)醇-氯化(hua)氫溶(rong)液(ye)中,血(xue)鏈球菌生物膜(mo)(mo)和浮(fu)游血(xue)鏈球菌的(de)(de)活菌數(shu)(shu)均顯著下(xia)降;而暴露于(yu)質(zhi)量(liang)分數(shu)(shu)0.05%的(de)(de)地(di)莫(mo)匹(pi)(pi)醇-氯化(hua)氫溶(rong)液(ye)中時,血(xue)鏈球菌生物膜(mo)(mo)細菌總數(shu)(shu)并未下(xia)降,浮(fu)游態血(xue)鏈球菌的(de)(de)活菌數(shu)(shu)則(ze)下(xia)降。即在(zai)(zai)生物膜(mo)(mo)形成的(de)(de)初始(shi)階(jie)段,地(di)莫(mo)匹(pi)(pi)醇-氯化(hua)氫溶(rong)液(ye)在(zai)(zai)0.05%或是更高(gao)的(de)(de)質(zhi)量(liang)分數(shu)(shu)下(xia)有(you)殺(sha)菌作用(yong),因而有(you)較大的(de)(de)臨床應用(yong)前景(jing)。
1.4 可見光和過氧化氫的抗菌協作效應
Steinberg等⒀利用可(ke)見(jian)(jian)光(guang)和(he)過(guo)氧(yang)化(hua)氫對浮(fu)游態(tai)變(bian)(bian)(bian)異鏈(lian)球(qiu)菌(jun)(jun)的(de)抗(kang)菌(jun)(jun)協作效應進行了證實性研究(jiu),在(zai)(zai)其研究(jiu)中檢測到一種可(ke)見(jian)(jian)光(guang)和(he)過(guo)氧(yang)化(hua)氫結合(he)體對生物(wu)(wu)膜(mo)(mo)(mo)中變(bian)(bian)(bian)異鏈(lian)球(qiu)菌(jun)(jun)的(de)活力和(he)基因表達的(de)影響力。結果顯示,生物(wu)(wu)膜(mo)(mo)(mo)中的(de)變(bian)(bian)(bian)異鏈(lian)球(qiu)菌(jun)(jun)在(zai)(zai)濃度為3~300mol/L過(guo)氧(yang)化(hua)氫中暴露(lu)于波長400~500nm可(ke)見(jian)(jian)光(guang)下0.5或(huo)1min,抗(kang)菌(jun)(jun)效果通過(guo)對死菌(jun)(jun)或(huo)活菌(jun)(jun)計數(shu),可(ke)見(jian)(jian)光(guang)和(he)過(guo)氧(yang)化(hua)氫結合(he)體在(zai)(zai)激光(guang)共聚(ju)焦掃(sao)描顯微鏡下對于生物(wu)(wu)膜(mo)(mo)(mo)每一層都有(you)一種協同性的(de)抗(kang)菌(jun)(jun)效果。此外,生物(wu)(wu)膜(mo)(mo)(mo)細菌(jun)(jun)在(zai)(zai)此種方(fang)法下較(jiao)浮(fu)游態(tai)細菌(jun)(jun)更有(you)效。綜(zong)上可(ke)見(jian)(jian),可(ke)見(jian)(jian)光(guang)和(he)過(guo)氧(yang)化(hua)氫結合(he)體可(ke)作為最低限度的(de)抗(kang)菌(jun)(jun)過(guo)程應用到生物(wu)(wu)膜(mo)(mo)(mo)相關疾病的(de)防治中。
2、細菌的基因表達和信號傳導
在牙菌斑生物膜中,細菌在應對生物膜所處的復雜環境時將啟動一套完全不同的基因系統,有不同的基因表達形式。Maira-Litr?觃n等⒁發現,生物膜中的菌細胞會表達一些跟浮游細胞不同的表型。細菌在生物膜中并非以游離狀態存在,而為了適應周邊環境,可通過種間或種內的信號傳導通路來協調群體的行為⒂,使群體細(xi)菌表現出共(gong)同的生(sheng)物(wu)學(xue)行為。
2.1 基因的轉錄分析
變異鏈球菌作為一種主要的口腔致病菌,常以生物膜的形式生活。Shemesh等⒃采(cai)用(yong)體外比較轉(zhuan)錄分析的(de)(de)方(fang)法(fa)來鑒(jian)定(ding)變異鏈球菌(jun)在生(sheng)(sheng)物(wu)膜狀(zhuang)態(tai)下和(he)浮游(you)(you)狀(zhuang)態(tai)時(shi)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表達(da),其DNA序列(lie)分析顯示,大約12%的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)有顯著性差異表達(da);在相對(dui)于浮游(you)(you)狀(zhuang)態(tai)而言的(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)膜狀(zhuang)態(tai)下,有139種基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)被(bei)激活,104種基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)被(bei)抑制(zhi),有20種被(bei)選(xuan)擇基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)差異表達(da)通過實時(shi)定(ding)量聚(ju)合酶鏈反應(ying)得以(yi)鑒(jian)定(ding)。該研究對(dui)變異鏈球菌(jun)生(sheng)(sheng)物(wu)膜生(sheng)(sheng)長過程中的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)表達(da)提供了新的(de)(de)見解。
2.2 不同糖源下的轉移酶應答
菌斑生物膜所處的環境反過來會對細菌的基因表達產生影響。Shemesh等⒄采用(yong)(yong)實(shi)時定量聚合酶(mei)鏈(lian)反應,體外對(dui)比變異鏈(lian)球(qiu)菌在(zai)生物(wu)(wu)(wu)膜狀態(tai)和(he)浮游(you)(you)狀態(tai)下(xia)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)關基(ji)因(yin)對(dui)葡萄(tao)糖(tang)和(he)蔗糖(tang)的(de)(de)(de)(de)應答。結果顯示,在(zai)相(xiang)(xiang)對(dui)于浮游(you)(you)狀態(tai)而言的(de)(de)(de)(de)生物(wu)(wu)(wu)膜狀態(tai)下(xia),所(suo)有(you)變異鏈(lian)球(qiu)菌被檢基(ji)因(yin)在(zai)生物(wu)(wu)(wu)膜中(zhong)起正(zheng)調節(jie)作用(yong)(yong)。在(zai)他們所(suo)檢測基(ji)因(yin)中(zhong),做得最多的(de)(de)(de)(de)是對(dui)編碼葡糖(tang)基(ji)轉移酶(mei)(glucosyltransferase,gtf)和(he)果糖(tang)基(ji)轉移酶(mei)(frucosyltransferase,ftf)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)觀(guan)察。結果顯示,gtfBmRNA的(de)(de)(de)(de)誘導(dao)作用(yong)(yong)在(zai)生物(wu)(wu)(wu)膜形(xing)成中(zhong)相(xiang)(xiang)對(dui)于浮游(you)(you)態(tai)是22倍,gtfCmRNA的(de)(de)(de)(de)增長作用(yong)(yong)在(zai)生物(wu)(wu)(wu)膜形(xing)成中(zhong)相(xiang)(xiang)對(dui)于浮游(you)(you)態(tai)是14.8倍,ftfmRNA的(de)(de)(de)(de)誘導(dao)作用(yong)(yong)在(zai)生物(wu)(wu)(wu)膜中(zhong)相(xiang)(xiang)對(dui)于浮游(you)(you)態(tai)是11.8倍。盡管在(zai)有(you)蔗糖(tang)存在(zai)時生物(wu)(wu)(wu)膜相(xiang)(xiang)關基(ji)因(yin)表(biao)達(da)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)正(zheng)性調節(jie)有(you)顯著意義,但是葡萄(tao)糖(tang)的(de)(de)(de)(de)加入(ru)會降低大部分基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)。由此(ci)可見,糖(tang)源的(de)(de)(de)(de)種類對(dui)生物(wu)(wu)(wu)膜狀態(tai)和(he)浮游(you)(you)態(tai)下(xia)細菌gtf和(he)ftf基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)起著重要的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。
2.3 生物膜的抗血清反應
口腔血鏈球菌是牙菌斑生物膜中的先鋒菌,也是口腔正常菌群的優勢菌之一,與其相對的浮游生物細胞在表型上完全不同。Black等⒅通過(guo)對血(xue)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)生物(wu)(wu)膜和浮(fu)游(you)生物(wu)(wu)細胞(bao)的(de)(de)表(biao)(biao)型分析證實,生長方式影響血(xue)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)表(biao)(biao)面性(xing)質。血(xue)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)生物(wu)(wu)膜經過(guo)抗(kang)(kang)血(xue)清(qing)反(fan)(fan)應(ying)后,其生物(wu)(wu)膜細菌(jun)(jun)(jun)基因(yin)庫(ku)中顯示產(chan)生了(le)32種基因(yin)重組克隆,表(biao)(biao)達(da)了(le)21種不同的(de)(de)血(xue)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)蛋白;另(ling)外,纖維黏附素CshA及其疏(shu)水性(xing)表(biao)(biao)達(da)在(zai)血(xue)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)生物(wu)(wu)膜中明顯提高。在(zai)對所選(xuan)用的(de)(de)大腸桿菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)不同分析中,其生物(wu)(wu)膜的(de)(de)抗(kang)(kang)血(xue)清(qing)反(fan)(fan)應(ying)有5次較(jiao)浮(fu)游(you)態(tai)細菌(jun)(jun)(jun)抗(kang)(kang)血(xue)清(qing)反(fan)(fan)應(ying)要強(qiang),即(ji)在(zai)生物(wu)(wu)膜細胞(bao)中,由cshA基因(yin)和cna基因(yin)編碼的(de)(de)表(biao)(biao)面膠原蛋白呈(cheng)正性(xing)調(diao)節,然而(er)在(zai)浮(fu)游(you)態(tai)中則(ze)不然。
2.4 密度感應信號系統
密度感應信號(quorumsensingsignal,QS)系統對牙菌斑生物膜的形成具有重要作用⒆,可改變菌體生理特性并影響生物膜的結構穩定性。對鏈球菌QS系統的研究發現,QS系統可誘導細菌接受外源性DNA,如生活在生物膜中的變異鏈球菌較浮游態下的變異鏈球菌更容易接受外源DNA,而且變異鏈球菌的轉化頻率是其浮游態的10~600倍⒇。大多數細菌利用QS系統調控其特定的生理功能,而且不同于浮游態下的細菌生長特點。生物膜內細菌的生理特性由密度感應信號系統調控,進而影響生物膜的發展成熟⑥。
3、細菌的代謝特點
3.1 細菌的耐酸性
心智成熟的怪物學工程膜癌神經元較在浮游壯態下而對于酸有更強的防御力。基因進化鏈球菌可在較低pH值氛圍下誘惑型出酸承受反饋以強化其生活力。Welin-Neilands等在依據死菌和活菌熒光印染探索基因進化鏈球菌怪物學工程膜的酸承受反饋水平及抗腐蝕性時中得知,不相同的基因進化鏈球菌菌株怪物學工程膜癌神經元的酸承受反饋水平是其相關浮游態下的820~7.0×104倍,較浮游癌神經元有更強的抗腐蝕性。時她們還得知,氟化物有限制酸承受反饋的誘惑型影響,在pH3.5氛圍下僅有77%的癌神經元生活率。常見,基因進化鏈球菌的不相同菌株存在不相同的酸承受度和不相同的誘惑型酸承受反饋的水平。3.2 細菌的抗饑餓性
與浮游態下的大腸桿菌相較于較,海洋生物工程制品膜中的大腸桿菌分泌優缺點享有多樣化性和復雜度性。Zhu等憑借皮秒激光共集中復印顯微鏡觀察和免疫檢測熒光技藝測得看到,海洋生物工程制品膜方式和浮游態中的遺傳遺傳變異鏈球菌并且接納24h無底物的饑餓治療后,遺傳遺傳變異鏈球菌在海洋生物工程制品膜方式下較浮游態享有更強的耐饑餓效果。4、結束語
所以微生物學膜中的結核桿菌無所謂是人類基因表達出、排泄率幫助,還是要同一的女性生理方面現像都是與浮游態下的結核桿菌有越大的差距;所以,研究分析微生物學膜中結核桿菌的女性生理方面排泄率共同點,這對于進一個步驟制定齲病和牙體病的疾患機能、防制安全措施以其專業指導醫學藥理聯合用藥均包括非常重要的醫學藥理功用。【參考文獻】
[1]Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP. Science,1999,284(5418):1318-1322. [2]Paster BJ,Boches SK,Galvin JL,et al. J Bacteriol,2001,183(12):3770-3783. [3]Rodríguez-Martínez JM,Pascual A. Enferm Infecc Mi-crobiol Clin,2008,26(2):107-114. [4]Spoering AL,Lewis K. J Bacteriol,2001,183(23):6746-6751. [5]Balaban NQ,Merrin J,Chait R,et al. Science,2004,305(5690):1622-1625. [6]ten Cate JM. Odontology,2006,94(1):1-9. [7]Wilson M,Patel H,Fletcher J. Oral Microbiol Immunol,1996,11(3):188-192. [8]Decker EM,Weiger R,von Ohle C,et al. Clin Oral Investig,2003,7(2):98-102. [9]Braga PC,Culici M,Alfieri M,et al. Int J Antimicrob Agents,2008,31(5):472-477. [10]Baehni PC,Takeuchi Y. Oral Dis,2003,9(Suppl 1):23-29. [11]Addy M,Moran J,Newcombe RG. J Clin Periodontol,2007,34(1):58-65. [12]Burgemeister S,Decker EM,Weiger R,et al. Eur J Oral Sci,2001,109(6):425-427. [13]Steinberg D,Moreinos D,Featherstone J,et al. Antimicrob Agents Chemother,2008,52(7):2626-2631. [14]Maira-Litran T,Allison DG,Gilbert P. J Appl Microbiol,2000,88(2):243-247. [15]Paster BJ,Boches SK,Galvin JL,et al. J Bacteriol,2001,183(12):3770-3783. [16]Shemesh M,Tam A,Steinberg D. Microbiology,2007,153(Pt 5):1307-1317. [17]Shemesh M,Tam A,Steinberg D. J Med Microbiol,2007,6(Pt 11):1528-1535. [18]Black C,Allan I,Ford SK,et al. Arch Oral Biol,2004,49(4):295-304. [19]Li YH,Tang N,Aspiras MB,et al. J Bacteriol,2002,184(10):2699-2708. [20]Li YH,Hanna MN,Svensater G,et al. J Bacteriol,2001,183(23):6875-6884. [21]Chen X,Schauder S,Potier N,et al. Nature,2002,415(6871):545-549. [22]Welin-Neilands J,Svensater G. Appl Environ Microbiol,2007,73(17):5633-5638. [23]Zhu M,Takenaka S,Sato M,et al. Oral Microbiol Immunol,2001,16(1):24-27.