中藥單體欖香烯體外對人晶狀體上皮細胞內膠原蛋白合成的影響
【摘要】目的：探討中藥單體欖香烯(xi)(effectsofe lemene,Ele)對人晶狀體上皮細胞(bao)系(xi)(humanlen sepithelialcellsB3,HLE B3)內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)和Ⅲ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)合成(cheng)的影響。方法：利用(yong)10μg/L堿性成(cheng)纖維細胞(bao)生長(chang)因子(recombinanthuman basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導HLE B3增殖，將80mg/L的Ele作(zuo)用(yong)在處于增殖狀態下(xia)的HLE B3，24h后(hou)采用(yong)雙抗體夾心ABC 酶聯免疫(yi)吸附測定法(enzyme linkedimmuno sorbentassay,ELISA)檢(jian)測Ele作(zuo)用(yong)后(hou)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)和Ⅲ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)表(biao)達(da)。結果(guo)：rhbFGF作(zuo)用(yong)后(hou)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)濃(nong)度為(wei)53.5±5.4μg/L，較正常(chang)組(38.5±2.3μg/L)明(ming)(ming)顯升(sheng)高(gao)，Ele作(zuo)用(yong)后(hou)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的濃(nong)度為(wei)29.5±2.9μg/L，較rhbFGF組明(ming)(ming)顯下(xia)降(P<0.01)。rhbFGF作(zuo)用(yong)后(hou)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅲ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)濃(nong)度為(wei)1.27±0.29μg/L，較正常(chang)組(0.83±0.12μg/L)明(ming)(ming)顯升(sheng)高(gao)，Ele作(zuo)用(yong)后(hou)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅲ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的濃(nong)度為(wei)0.69±0.11μg/L，較rhbFGF組明(ming)(ming)顯下(xia)降(P<0.01)。結論(lun)：Ele抑制rhbFGF誘導的HLE B3增殖的同(tong)時也能抑制HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ，Ⅲ型(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)合成(cheng)，干擾HLE B3纖維化(hua)，可望(wang)成(cheng)為(wei)防治后(hou)囊膜混(hun)濁的理(li)想藥物(wu)。
【關鍵詞】欖香烯晶狀體;上皮細胞后囊膜混濁;Ⅰ型膠原蛋白;Ⅲ型膠原蛋白
引言
膠原蛋白(collagen)或稱膠原，是動物細胞合成的一種生物性高分子，是一類最主要的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)。目前的研究表明，ECM與后囊膜混濁的關系密切：ECM是構成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ，Ⅲ和IV型膠原;此外ECM還可調節細胞生長分化及細胞運動。欖香烯(elemene，Ele)是天然藥物莪術的主要成分，具有抗血栓形成、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡①②，我們(men)的研究發現(xian)Ele能抑制由(you)重(zhong)組(zu)人堿(jian)性(xing)成(cheng)纖維細胞生(sheng)長因子(recombinant human basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)誘導的人晶狀體(ti)(ti)上皮細胞系(humanlensepithelialcellsB3,HLE B3)增殖(zhi)(另(ling)文報道)，我們(men)進一步采(cai)用雙抗體(ti)(ti)夾心ABC酶聯免(mian)疫吸附測定法(enzyme linke dimmunosorbentassay，ELISA)檢測Ele作用后HLE B3內Ⅰ型膠原蛋(dan)白(collagenI)和(he)Ⅲ型膠原蛋(dan)白(collagenIII)表達，探討Ele是否在(zai)抑制HLE B3增殖(zhi)的同時還能抑制HLE B3內Ⅰ和(he)Ⅲ型膠原蛋(dan)白的合成(cheng)，從而(er)對阻止(zhi)晶狀體(ti)(ti)上皮細胞纖維化(hua)起重(zhong)要的作用。
1、材料和方法
1.1 材料
人晶狀體上皮癌細胞系系HLE B3由成都中山二本大學眼科醫生探索中帶來;Ele保濕乳液，溶化度99.0%，威海金港制藥廠受限廠家;rhbFGF為英國媒體PeproTech廠家;DMEM養成出出來基、胰蛋清酶和EDTA各用是韓國Gibco廠家、韓國Amresco廠家和韓國Augus廠家;Ⅰ型膠原蛋清(collagenI)和Ⅲ型膠原蛋清(collagenIII)的ELISA實驗試劑盒由蘇州西唐微生物科持受限廠家帶來。手動酶標讀數儀：韓國BioTekELX808;倒放探索顯微鏡觀察：俄羅斯IMT 413;二氧化物碳養成出出來箱：韓國FORMA2111。取下儲存凍存癌細胞系的凍存管之后植入37℃池中，將溶化的癌細胞系懸液用10倍體型這些的養成出出來液做稀釋溶解，離心力，除上清，不斷洗滌3次。以5×107個/L疫苗注射于養成出出來瓶中，37℃，50mL/LCO2養成出出來箱養成出出來。待癌細胞系的生長相融后做傳代養成出出來。1.2 方法
80mg/LEle用24h后匯集內部上清液;掏出早已包被了抗人Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白肽酶粉質單克隆抵抗能力陽性的96微孔板板。設準則化孔8孔，每孔各倒入準則化配制液100mL，一孔加準則化品100μL，均衡后用加樣器吸出100μL，移至第2孔。都是這樣致使反復算計倍配制至第7孔，然后從第7孔中吸出100μL棄去，使之體積大概均為100μL，第8孔為空頁組。待測品孔每孔各倒入內部上清液100μL，每組6個孔;將生理想法板充沛混勻后置攝像頭37℃，120min;用干洗液將生理想法板充沛干洗5次，在濾膜上印干;每孔加1抵抗能力陽性業務液50μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加酶標抵抗能力陽性業務液100μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加底物業務液100μL，置37℃暗處生理想法10min;每孔加50μL撤消液混勻。在492nm處測吸光度值;按照其準則化品A值描出準則化線條，按照其樣品管理A值在該線條圖上看出合理的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白肽酶粉質成分。 數劇匯總學深入分析：數劇以均數±準則差(±s)表達出來，通過SPSS12.0數劇匯總軟件進行數劇處里。2、結果
rhbFGF組HLE B3內Ⅰ型膠原質濃度較沒字一片組清晰多，與沒字一片組中間地域不同兼具匯總學意議(P<0.01;Ele組HLE B3內Ⅰ型膠原質濃度較rhbFGF組清晰走低，與rhbFGF組中間地域不同兼具匯總學意議(P<0.01)。證明Ele能變低HLE B3內Ⅰ型膠原質濃度。rhbFGF組HLE B3內Ⅲ型膠原質濃度較沒字一片組清晰多，與沒字一片組中間地域不同兼具匯總學意議(P<0.01);Ele組HLE B3內Ⅲ型膠原質濃度都較rhbFGF組清晰走低，與rhbFGF組中間地域不同兼具匯總學意議(P<0.01)。證明Ele能變低HLE B3內Ⅲ型膠原質濃度。Ele對HLE B3內Ⅰ，Ⅲ型膠原質濃度的影向3、討論
膠原蛋白或稱膠原，是動物細胞合成的一種生物性高分子，是ECM中最主要的一類物質。經過數十年來的研究和發展,業已發現并確認了膠原蛋白有25種類型，其中Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白約占膠原蛋白總量的80%～90%。膠原蛋白纖維化是許多疾病的病理表現之一，膠原蛋白分子的異常合成和沉積是纖維化反應的基礎。如彌漫性肺纖維化早期表現為肺泡炎，后期為彌漫性肺間質纖維化,主要是肺間質中成纖維細胞數及其產生的膠原蛋白和其他結締組織成分增多，肺泡壁遭破壞，特發性肺間質纖維化時，肺組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原增高，肺臟變硬，順應性減退③。有研究表明，高血壓左心室肥厚時不僅存在心肌肥大的變化，心肌間質纖維化亦是重要的病理改變，Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白的表達增強,促進了間質的纖維化④。ECM是構成纖維化性混濁的重要成分。免疫電鏡檢查顯示混濁的晶狀體后囊膜的纖維有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原，ECM可調節細胞生長分化及細胞運動。纖維粘連蛋白等ECM可促進某些黏附分子磷酸化，從而促進細胞移行。白內障摘除術后，殘留的晶狀體上皮細胞通過細胞膜上的黏附分子與細胞外基質及細胞內骨架蛋白相連，促使細胞移行并發生晶狀體后囊膜皺縮。Ishida等⑤研究發現：米諾地爾能抑制體外培養的晶狀體上皮細胞的增殖、移行及膠原分泌。張鳳妍等⑥探討表皮生(sheng)長因子、白(bai)(bai)(bai)細(xi)胞(bao)介(jie)素(su)1、干擾(rao)素(su)和(he)(he)(he)生(sheng)長抑素(su)8肽在晶狀體(ti)(ti)后(hou)(hou)囊膜混濁(zhuo)形成(cheng)(cheng)中的(de)(de)作(zuo)用(yong)及(ji)影響(xiang)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)合成(cheng)(cheng)的(de)(de)機(ji)制，發(fa)現(xian)表皮生(sheng)長因子、白(bai)(bai)(bai)細(xi)胞(bao)介(jie)素(su)1參與晶狀體(ti)(ti)后(hou)(hou)囊膜混濁(zhuo)形成(cheng)(cheng)時的(de)(de)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)合成(cheng)(cheng)，干擾(rao)素(su)和(he)(he)(he)生(sheng)長抑素(su)8肽的(de)(de)作(zuo)用(yong)提(ti)(ti)示(shi)其(qi)可用(yong)于防(fang)治晶狀體(ti)(ti)后(hou)(hou)囊膜混濁(zhuo)。在本研究中，10μg/LrhbFGF作(zuo)用(yong)后(hou)(hou)，HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)濃度(du)為53.5±5.4μg/L，較(jiao)(jiao)正常組(zu)(38.5±2.3μg/L)明(ming)(ming)顯升(sheng)(sheng)高(gao)(gao)，說明(ming)(ming)rhbFGF能(neng)促進(jin)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)合成(cheng)(cheng)。經Ele作(zuo)用(yong)后(hou)(hou)，HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)濃度(du)為29.5±2.9μg/L，較(jiao)(jiao)rhbFGF組(zu)明(ming)(ming)顯下降(jiang)。結果(guo)提(ti)(ti)示(shi)，Ele能(neng)抑制HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)合成(cheng)(cheng)。我(wo)們還(huan)發(fa)現(xian)，10μg/LrhbFGF作(zuo)用(yong)后(hou)(hou)，HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)濃度(du)為1.27±0.29μg/L，較(jiao)(jiao)正常組(zu)(0.83±0.12μg/L)明(ming)(ming)顯升(sheng)(sheng)高(gao)(gao)，說明(ming)(ming)rhbFGF能(neng)促進(jin)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)合成(cheng)(cheng)。經Ele作(zuo)用(yong)后(hou)(hou)，HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)濃度(du)為0.69±0.11μg/L，較(jiao)(jiao)rhbFGF組(zu)明(ming)(ming)顯下降(jiang)。本結果(guo)提(ti)(ti)示(shi)，Ele能(neng)抑制HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)合成(cheng)(cheng)。本結果(guo)提(ti)(ti)示(shi)，rhbFGF在促進(jin)HLE B3增殖的(de)(de)同(tong)時，也能(neng)促進(jin)HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)、Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)合成(cheng)(cheng);Ele能(neng)有效(xiao)抑制HLE B3內(nei)(nei)(nei)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)、Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)合成(cheng)(cheng)。進(jin)一步說明(ming)(ming)作(zuo)為ECM重(zhong)(zhong)要(yao)成(cheng)(cheng)分的(de)(de)Ⅰ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)和(he)(he)(he)Ⅲ型(xing)(xing)(xing)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)蛋白(bai)(bai)(bai)，是構成(cheng)(cheng)纖維化(hua)性(xing)混濁(zhuo)的(de)(de)重(zhong)(zhong)要(yao)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)因，也是導致(zhi)晶狀體(ti)(ti)后(hou)(hou)囊膜纖維化(hua)并(bing)發(fa)生(sheng)混濁(zhuo)的(de)(de)重(zhong)(zhong)要(yao)機(ji)制。Ele有望成(cheng)(cheng)為防(fang)治后(hou)(hou)發(fa)性(xing)白(bai)(bai)(bai)內(nei)(nei)(nei)障(zhang)的(de)(de)有效(xiao)藥物。
【參考文獻】
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