白細胞介素12基因修飾大鼠膠質瘤9L/ rIL-12細胞的建立

發布時間：2011/11/10 13:57:48

【摘要】目的(de)(de)(de)(de)：構建(jian)大鼠(shu)白細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)介(jie)素12(rIL-12)基因(yin)(yin)真核表(biao)達(da)(da)(da)(da)載體質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)，建(jian)立rIL-12基因(yin)(yin)修(xiu)(xiu)飾(shi)并(bing)(bing)穩定表(biao)達(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)大鼠(shu)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)瘤(liu)(liu)9L/rIL-12細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。方(fang)法(fa)(fa)：用Trizol提(ti)取大鼠(shu)腹(fu)腔巨噬細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)總(zong)RNA，RT-PCR方(fang)法(fa)(fa)分(fen)(fen)別(bie)獲取rp40和rp35cDNA，依次克(ke)隆(long)入pcDNA3.1(-)/myc-HisA質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)中(zhong)(zhong)，以IRES連接(jie)雙(shuang)亞(ya)基，構建(jian)成雙(shuang)順反子(zi)真核表(biao)達(da)(da)(da)(da)載體質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pcDNA3.1/rIL-12。將構建(jian)的(de)(de)(de)(de)重組質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)轉(zhuan)染(ran)大鼠(shu)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)瘤(liu)(liu)9L細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，G418篩選單克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)株(zhu)，ELISA法(fa)(fa)檢測其(qi)培養上(shang)清(qing)rIL-12(p70)蛋白含量，同時(shi)抽提(ti)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)RNA，RT-PCR方(fang)法(fa)(fa)檢測rp40、rp35基因(yin)(yin)在9L/rIL-12細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)(da)(da)。結(jie)(jie)果(guo)：所得(de)rp40cDNA序列與GeneBankNM022611及(ji)AF133197、rp35cDNA序列與GeneBankNM053390及(ji)AF177031均一(yi)致，構建(jian)的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)經PCR、酶切及(ji)測序鑒定正確。質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)轉(zhuan)染(ran)9L細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)后，獲得(de)2個(ge)rIL-12基因(yin)(yin)穩定、高(gao)效表(biao)達(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)9L/rIL-12單克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)株(zhu)，其(qi)培養上(shang)清(qing)rIL-12(p70)蛋白含量分(fen)(fen)別(bie)為139.0、162.1pg/ml，RT-PCR結(jie)(jie)果(guo)顯(xian)示細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)rIL-12基因(yin)(yin)表(biao)達(da)(da)(da)(da)呈陽性。結(jie)(jie)論(lun)：成功構建(jian)了(le)rIL-12真核表(biao)達(da)(da)(da)(da)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pcDNA3.1/rIL-12，并(bing)(bing)建(jian)立了(le)9L/rIL-12細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)株(zhu)，為rIL-12基因(yin)(yin)修(xiu)(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)膠(jiao)(jiao)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)瘤(liu)(liu)疫(yi)苗研究打下了(le)基礎。

【關鍵詞】大鼠 白細胞(bao)介素(su)12質粒(li) 神(shen)經膠質瘤(liu) 9L細胞(bao)

免疫療法被視為有前景的膠質瘤治療新模式。利用免疫細胞因子及基因治療可以增強機體抗腫瘤的免疫反應，其中白細胞介素12(IL-12)以其廣泛的生物學效應、強大的抗腫瘤作用，被譽為最有效的抗腫瘤細胞因子之一^①②。

本探析充分利用脂多糖(LPS)暢快休外培養教育的大鼠腹腔巨噬體生殖內部核，提煉體生殖內部核RNA，RT-PCR增加出大鼠IL-12(rIL-12)的rp40及rp35cDNA，將之先后順序亞克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA質粒中，連在一起脊髓灰質炎新冠病毒的內核糖體流入位點(internalribosomeentrysite，IRES)做好拼接，融合成rp40及rp35兩亞基的雙順反子真核描述質粒pcDNA3.1/rIL-12，用途該質粒轉染大鼠膠質瘤9L體生殖內部核，搭建rIL-12基因遺傳保持穩定描述的9L/rIL-12體生殖內部核株。

1、材料與方法

1.1  細菌、質粒與細胞大腸桿菌感受態細胞DH-5α為Tiangen產品。pcDNA3.1(-)/myc-HisA/IRES質粒由英國格拉斯哥(ge)大(da)學(xue)免疫和細(xi)菌(jun)學(xue)室XiaoqingWei博(bo)士惠贈。野生(sheng)型(xing)大(da)鼠膠(jiao)質瘤(liu)9L細(xi)胞株(zhu)由美國洛杉磯加州大(da)學(xue)神(shen)經外科LindaMLiau博(bo)士惠贈。

1.2 實驗 動(dong)物雄性(xing)Wistar大鼠(shu)購于南(nan)方醫科大學(xue)實驗(yan)動(dong)物中心(粵檢證字2002A041)，5~6周(zhou)齡，體質量(250±50)g，由廣(guang)州軍區廣(guang)州總醫院醫學(xue)實驗(yan)動(dong)物中心按清潔級動(dong)物飼養。

1.3 主要試劑 LPS為(wei)(wei)(wei)Sigma產品(pin)(pin)(pin)(pin)，Trizol、G418、LipofectamineTM2000為(wei)(wei)(wei)Invitrogen產品(pin)(pin)(pin)(pin)，各(ge)種限制性內切酶、高(gao)保真PyrobestTaq酶、T4DNA連接(jie)酶為(wei)(wei)(wei)TaKaRa產品(pin)(pin)(pin)(pin)，反轉錄(lu)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)為(wei)(wei)(wei)Promega產品(pin)(pin)(pin)(pin)，凝(ning)膠回收試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)為(wei)(wei)(wei)U-gene產品(pin)(pin)(pin)(pin)，質粒提取試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)為(wei)(wei)(wei)Tiangen產品(pin)(pin)(pin)(pin)，大鼠IL-12(p70)ELISA試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)為(wei)(wei)(wei)Biosource產品(pin)(pin)(pin)(pin)，DMEM、胎牛血(xue)清(FBS)均為(wei)(wei)(wei)Gibco產品(pin)(pin)(pin)(pin)。

1.4 引物設計與合成 參照(zhao)GeneBank中rIL-12的(de)(de)cDNA序列，利用VectorNTIAdvance10軟(ruan)件設計(ji)rp40和rp35的(de)(de)PCR引(yin)(yin)物(wu)，rp40上(shang)(shang)(shang)游(you)引(yin)(yin)物(wu)5'端加上(shang)(shang)(shang)XhoⅠ(CTCGAG)酶(mei)(mei)切位(wei)點(dian)，下游(you)引(yin)(yin)物(wu)5'端加上(shang)(shang)(shang)NotⅠ(GCGGCCGC)酶(mei)(mei)切位(wei)點(dian)，rp35上(shang)(shang)(shang)游(you)及(ji)下游(you)引(yin)(yin)物(wu)5'端均(jun)加上(shang)(shang)(shang)EcoRⅠ(GAATTC)酶(mei)(mei)切位(wei)點(dian)。以甘油醛-3-磷酸脫氫(qing)酶(mei)(mei)(GAPDH)基因(yin)為RT-PCR內參，長度為252bp(表1)。引(yin)(yin)物(wu)由上(shang)(shang)(shang)海英駿生(sheng)物(wu)技術有限公(gong)司合(he)成。

1.5 大鼠腹腔巨噬細胞的制備及IL-12基因的克隆 參照文獻^③提取Wistar大鼠腹腔(qiang)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)，加入10μg/mlLPS培養12～24h，收集細(xi)胞(bao)，Trizol提取細(xi)胞(bao)總RNA，反轉(zhuan)錄合成cDNA。以cDNA為模板，分(fen)別(bie)用rp40、rp35引物(wu)PCR擴增rp40、rp35基(ji)(ji)(ji)因片(pian)段(duan);反應(ying)條件(jian)：預(yu)變性94℃5min，94℃45s、63℃45s、72℃45s循環30次，延伸(shen)72℃5min，4℃保持。1%瓊脂糖凝(ning)膠電泳分(fen)離PCR產物(wu)，紫外燈(deng)下切(qie)割(ge)目(mu)標(biao)基(ji)(ji)(ji)因條帶，凝(ning)膠回收基(ji)(ji)(ji)因片(pian)段(duan)。分(fen)別(bie)以XhoⅠ、NotⅠ雙酶(mei)切(qie)rp40基(ji)(ji)(ji)因片(pian)段(duan)，EcoRⅠ單酶(mei)切(qie)rp35基(ji)(ji)(ji)因片(pian)段(duan)，酶(mei)切(qie)產物(wu)電泳分(fen)離，再次凝(ning)膠回收、純化(hua)，獲得可(ke)以用于亞克(ke)隆(long)的兩基(ji)(ji)(ji)因片(pian)段(duan)。

1.6 重組質粒pcDNA3.1/rIL-12的構建及鑒定 具體方法參照文獻^④，分(fen)兩步構建(jian)(jian)：首(shou)先以(yi)(yi)XhoⅠ、NotⅠ雙酶(mei)(mei)(mei)切載體(ti)(ti)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES，回(hui)(hui)收(shou)線性化(hua)的(de)(de)(de)載體(ti)(ti)片(pian)段并與(yu)(yu)rp40基因片(pian)段連接(jie)，構建(jian)(jian)中(zhong)間(jian)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pcDNA3.1/rp40-IRES。然后(hou)以(yi)(yi)EcoRⅠ單(dan)(dan)酶(mei)(mei)(mei)切質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pcDNA3.1/rp40-IRES，回(hui)(hui)收(shou)線性化(hua)的(de)(de)(de)載體(ti)(ti)片(pian)段，再與(yu)(yu)rp35基因片(pian)段連接(jie)構建(jian)(jian)pcDNA3.1/rp40-IRES-rp35(即重(zhong)組(zu)(zu)(zu)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)pcDNA3.1/rIL-12)。以(yi)(yi)重(zhong)組(zu)(zu)(zu)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)為(wei)模板，PCR鑒(jian)定(ding)rp40、rp35基因的(de)(de)(de)表(biao)達。分(fen)別用EcoRⅠ單(dan)(dan)酶(mei)(mei)(mei)切、XbaⅠ單(dan)(dan)酶(mei)(mei)(mei)切、XbaⅠ和NotⅠ雙酶(mei)(mei)(mei)切重(zhong)組(zu)(zu)(zu)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)，并利用VectorNTIAdvance10軟(ruan)件預測(ce)酶(mei)(mei)(mei)切結(jie)果(guo)。質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)DNA測(ce)序由(you)大連寶生物工程有限公司完(wan)成，以(yi)(yi)測(ce)序結(jie)果(guo)鑒(jian)定(ding)rp35基因插入(ru)方向正(zheng)確(que)與(yu)(yu)否。構建(jian)(jian)的(de)(de)(de)重(zhong)組(zu)(zu)(zu)質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)經鑒(jian)定(ding)正(zheng)確(que)后(hou)，大提質(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)備(bei)用。

1.7 質粒pcDNA3.1/rIL-12轉染9L細胞9L細胞的培養參照文獻^⑤。重(zhong)組質粒采(cai)用脂(zhi)質體介(jie)導(dao)方法和電(dian)穿孔方法轉染野(ye)生型(xing)9L細胞。脂(zhi)質體介(jie)導(dao)轉染方法按LipofectamineTM2000說明書(shu)進行。電(dian)穿孔方法按GenepulserXcellTMelectroperationSystem(BioRad產品)操(cao)作指南進行，參(can)數為方波、300V、20ms。

1.89 L/rIL-12單克隆細胞株的建立及rIL-12的表達 質粒轉染9L細(xi)(xi)胞后，G418(終濃度600μg/ml)篩選7～14d，采用有(you)限稀(xi)釋(shi)法和畫圈法挑(tiao)取(qu)(qu)(qu)單克(ke)隆(long)細(xi)(xi)胞株培(pei)養、擴增、傳(chuan)代。將篩選的(de)單克(ke)隆(long)細(xi)(xi)胞株各代細(xi)(xi)胞分別(bie)取(qu)(qu)(qu)5×106細(xi)(xi)胞數(shu)，用10ml含G418的(de)DMEM完全(quan)培(pei)養液定(ding)量培(pei)養72h，取(qu)(qu)(qu)上清，按Biosource試劑盒說明書，采用ELISA方法檢(jian)測rIL-12(p70)濃度;同(tong)時(shi)用Trizol抽(chou)提細(xi)(xi)胞的(de)總RNA，RT-PCR檢(jian)測細(xi)(xi)胞中(zhong)rp40、rp35基因的(de)表達。

2、結果

2.1 rIL-12基因克隆及重組質粒構建 經(jing)LPS刺激(ji)的大(da)鼠腹腔巨噬細胞提取的RNA經(jing)RT-PCR擴增(zeng)出rp40及rp35cDNA片(pian)段，大(da)小分別約(yue)為1008bp和(he)647bp，酶切純化(hua)后(hou)依次亞克(ke)隆入(ru)載(zai)體質粒(li)(li)pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES相(xiang)應的位點，構建成rp40和(he)rp35兩(liang)亞基(ji)雙順反(fan)子(zi)真(zhen)核(he)表達(da)的重組質粒(li)(li)pcDNA3.1/rIL-12。

2.2 重組質粒鑒定 以重(zhong)組質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)為模板行PCR擴增，產物電(dian)泳顯示rp40和(he)rp35條(tiao)帶(dai)清晰。質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)酶(mei)切(qie)(qie)(qie)鑒(jian)定，電(dian)泳條(tiao)帶(dai)與(yu)(yu)預測(ce)吻合，其中EcoRⅠ單酶(mei)切(qie)(qie)(qie)可(ke)將插(cha)入的rp35基因(yin)切(qie)(qie)(qie)下;rp40基因(yin)中存在1個XbaⅠ酶(mei)切(qie)(qie)(qie)位點(dian)，XbaⅠ單酶(mei)切(qie)(qie)(qie)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)出現(xian)3條(tiao)帶(dai);XbaⅠ和(he)NotⅠ雙(shuang)酶(mei)切(qie)(qie)(qie)因(yin)緩(huan)沖體(ti)系不同僅出現(xian)2條(tiao)帶(dai)。重(zhong)組質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)測(ce)序(xu)結果與(yu)(yu)GeneBank比(bi)對，rp40cDNA序(xu)列與(yu)(yu)NM022611及(ji)AF133197、rp35cDNA序(xu)列與(yu)(yu)NM053390及(ji)AF177031均一致，rp35基因(yin)插(cha)入載體(ti)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)方向(xiang)正確。

2.3 9L/rIL-12細胞的建立及rIL-12基因表達 重組質(zhi)粒轉染野生型大鼠9L細(xi)胞后，共獲得(de)12個9L/rIL-12單克(ke)隆(long)細(xi)胞株(zhu)，其中第2、7號(hao)單克(ke)隆(long)細(xi)胞株(zhu)傳至第5代(dai)，以5.0×106細(xi)胞數/10ml定(ding)量培(pei)養72h，ELISA檢(jian)測培(pei)養上清中rIL-12(p70)蛋(dan)白濃度分別為139.0、162.1pg/ml。Trizol抽提2、7號(hao)克(ke)隆(long)株(zhu)第5代(dai)細(xi)胞總RNA，RT-PCR結果顯示(shi)rp35和rp40基(ji)因表達均為陽性。

3、討論

IL-12最早稱為自然殺傷細胞刺激因子(NKCSF)^⑥或細胞毒淋巴細胞成熟因子(CLMF)^⑦。IL-12具有廣泛的生物學活性，主要有以下功能：①促進T細胞及NK細胞增殖，并通過促進分泌IFNγ而增強其殺傷活性;②促進Th1型細胞免疫反應;③促進多種黏附分子和MHC分子的表達，從而增強腫瘤細胞的免疫原性;④抑制瘤體內新生血管形成，從而抑制腫瘤生長;⑤促進一氧化氮生成，導致腫瘤細胞凋亡;⑥特別具有對抗TGF-β、PGE-2、IL-10、IGF-Ⅰ等膠質瘤分泌的免疫抑制細胞因子作用，從而有助于改善腫瘤局部免疫抑制狀態的微環境。IL-12是最有效的抗腫瘤細胞因子之一，是連接體內天然免疫與特異性免疫的橋梁^①②。

IL-12主要由抗原提呈細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞等以“旁分泌”的形式在局部發揮作用。全身給藥時，不僅腫瘤局部IL-12濃度難以達到抗腫瘤的要求，而且大劑量的反復應用可引起嚴重副反應，在腦瘤治療中可引起嚴重腦水腫。將IL-12基因轉導細胞后再用于體內，通過細胞表達，IL-12以旁分泌的形式在局部發揮作用，副反應小，更符合其在體內作用的生理模式^⑧。

IL-12是由二硫鍵連接兩亞基的異二聚體，兩亞基相對分子質量為35ku和40ku，由位于不同染色體上的基因p35和p40編碼，其中p35亞基決定IL-12的種屬特性，而p40亞基包含與IL-12受體結合的必需基團，且其前端包含促進IL-12分泌至細胞外的信號肽。p40單體或同二聚體可與IL-12競爭結合受體而強烈拮抗IL-12的生物學活性，在轉染哺乳動物細胞時，只有兩亞基在體內等量表達并正確折疊，才能形成有生物學活性的IL-12^⑥⑦。因此，采用其進行基因治療前，必須構建兩亞基等量共表達的載體^⑨。目前國內(nei)外學(xue)者多采用IRES連(lian)接p40和p35的(de)(de)方法構建(jian)雙亞基共表(biao)達的(de)(de)載體，通過IRES在(zai)翻譯過程中的(de)(de)內(nei)啟動作用實現同一轉錄(lu)水平(ping)上的(de)(de)等量表(biao)達。

國內已經有成功克隆小鼠IL-12基因的報道^⑩，但大(da)鼠(shu)(shu)(shu)IL-12基因克(ke)隆尚未(wei)見文獻報告(gao)。本研(yan)究通過提取大(da)鼠(shu)(shu)(shu)腹腔(qiang)巨噬細胞(bao)(bao)總RNA，RT-PCR擴增出rIL-12的(de)rp40及(ji)rp35cDNA，將(jiang)其(qi)依次克(ke)隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA質(zhi)粒(li)中(zhong)，并用IRES連接(jie)，構(gou)建(jian)成(cheng)同時含rIL-12rp40及(ji)rp35兩亞基的(de)雙順反(fan)子真(zhen)核(he)表(biao)(biao)達質(zhi)粒(li)pcDNA3.1/rIL-12。將(jiang)構(gou)建(jian)的(de)質(zhi)粒(li)轉染大(da)鼠(shu)(shu)(shu)膠質(zhi)瘤(liu)(liu)細胞(bao)(bao)9L，獲得rIL-12基因穩定表(biao)(biao)達的(de)9L/rIL-12單克(ke)隆細胞(bao)(bao)株，其(qi)培(pei)養上(shang)清(qing)經ELISA檢測，rIL-12(p70)蛋白分泌量達139.0、162.1pg/ml。大(da)鼠(shu)(shu)(shu)IL-12雙順反(fan)子真(zhen)核(he)表(biao)(biao)達質(zhi)粒(li)pcDNA3.1/rIL-12的(de)成(cheng)功構(gou)建(jian)及(ji)9L/rIL-12細胞(bao)(bao)株的(de)建(jian)立，為IL-12基因修(xiu)飾的(de)大(da)鼠(shu)(shu)(shu)膠質(zhi)瘤(liu)(liu)疫苗研(yan)究打(da)下了基礎。

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